date:2019-03-02 13:55:07
細胞遷移發(fā)生在很多重要的生理過程中。比如，胚胎發(fā)育，組織損傷和傷口愈合的過程中細胞的遷移就是受到調控的。相反，細胞遷移在許多病理情況比如癌癥轉移和炎癥下是失調的。不足為奇，許多細胞遷移的原理已經在很多情況下研究過了。
1. 傷口愈合和遷移實驗的應用
傷口愈合和遷移實驗是廣泛用于不同條件下分析細胞遷移的方法。
他們有助于理解下面相關的科學問題。
1 不同條件下遷移和傷口愈合研究：
細胞如何在不同條件下遷移（比如，被特定的化合物/增強劑/抑制劑處理后，SiRNA或者CRISPR/Cas9基因沉默后，底物硬度改變后，或者基質組成改變后）
2 高通量藥物篩選：
哪一種藥物可以改變特定細胞的遷移速率（比如，癌細胞）
3 細胞相互作用研究：
細胞是保持相互接觸，還是異常遷移。遷移過程中細胞是如何相互作用的。 細胞自主性的遷移能力如何？
4 2D侵襲實驗：
兩種不同類型細胞如何相互作用（比如腫瘤細胞和成纖維細胞）
和一般的傷口愈合和遷移不同，定向遷移實驗，比如細胞趨化實驗，測定在2D或者3D環(huán)境下濃度梯度依賴的細胞運動。
2D侵襲實驗中兩種不同類型的細胞 抑制劑或增強劑對傷口愈合影響的示例
2. 如何做一個傷口愈合和遷移實驗
典型的傷口愈合和遷移實驗的結果就是隨著時間的變化細胞覆蓋面積（傷口閉合）的變化。
進行傷口愈合和遷移實驗是一個非常簡單的操作。
1 在細胞單層間制造出一個物理傷口。
2 在不同時間點進行拍照，或者進行實時成像觀察細胞遷移到傷口的過程。
3 采用手動或者自動化軟件分析傷口閉合的速率，這就是典型的實驗結果。
盡管傷口愈合實驗很簡單，但是許多因素會影響到實驗結果。因此要控制好這些因素。
下面我們討論一下傷口愈合的實驗設置和原理。此外，我們還要討論一些需要標準化的參數，從而獲得可重復，穩(wěn)定的結果。
MCF7細胞傷口形成后傷口閉合的活細胞成像圖
傷口愈合實驗流程圖
開始實驗之前需要回答以下問題：
1 能否重復細胞培養(yǎng)條件？
由于許多外部因子可能影響到傷口愈合實驗的結果，這就需要事先開發(fā)出一個標準的方法學。
整個實驗過程中的步驟需要保持一致。如果可以，每一次實驗所用到的設備，細胞代數，培養(yǎng)液替換次數，試劑和耗材都應當一樣。
2 應該用哪一種細胞培養(yǎng)器皿？
細胞培養(yǎng)器皿需要有一個薄底（-170μm），這樣對于高分辨率活細胞成像和倒置顯微鏡是出色的。（比如，ibidi多聚物玻片）培養(yǎng)器皿的大小需要便于傷口的形成。根據樣本數量，ibidi有μ培養(yǎng)皿（35mm高壁）的培養(yǎng)插件或者μ-24孔培養(yǎng)板可以選擇使用。如果不需要高分辨率熒光顯微鏡成像，培養(yǎng)插件也可以自己插入到各種規(guī)格的培養(yǎng)器皿里，比如培養(yǎng)皿，細胞培養(yǎng)小室，多孔板。
3 應該使用哪種基底？
哪種基底取決于細胞類型和實驗條件。組織處理的基底可以給細胞提供足夠的吸附。
就像ibidi多聚物玻片，適用于大多數細胞類型。然而有些細胞類型需要一些特殊的包被。
關于詳細的如何自己包被μ玻片和μ培養(yǎng)皿可以查看ibidi細胞包被的應用指南。
4 需不需要抑制細胞增殖？
在傷口愈合實驗中，細胞不僅僅會遷移到傷口處，而且也會增殖。在形成傷口前，可以使用增殖抑制劑比如mitomycin 或者 actinomycin C處理細胞來抑制增殖。但是需要事先確定好劑量和相應的對照，這樣細胞不會因為生長抑制的藥物而造成細胞凋亡或者改變了遷移能力。
5 理想的細胞密度是多少？
理想狀態(tài)下，傷口愈合實驗應該是在顯微鏡下觀察到細胞單層長滿后立即進行。細胞接種密度需要根據不同細胞類型來分別確定。出色的狀態(tài)就是細胞在接種24小時形成單細胞層。
6 如何形成傷口？
生成的傷口的一致性對于傷口愈合實驗是其重要。目前有幾種在單層細胞形成傷口的方法：用針或者槍頭劃，放入一個插件或者膜具，化學表面處理，或者用電處理等，不同方法各有優(yōu)缺點。
7 傷口閉合如何監(jiān)測？
在不同時間點進行拍照觀察傷口閉合是可以的。但是對于絕大多數實驗設計來講，活細胞成像是精確，也是很方便地監(jiān)測傷口閉合的。
3. 傷口愈合實驗流程：
1樣本制備
步驟：使用Ibidi培養(yǎng)插件形成的傷口，由于無細胞傷口的大小固定，這就確保了高度可重復性。
在合適的培養(yǎng)器皿里面選擇恰當的培養(yǎng)插件。接種培養(yǎng)細胞到顯微鏡下長滿，形成單層。讓細胞生長大約24小時，如果有必要，可以用增殖抑制劑處理細胞，然后移除培養(yǎng)插件形成傷口。
Ibidi的解決方法：
Ibidi培養(yǎng)插件2孔，3孔，四孔是特定大小細胞傷口的硅膠插件，用于傷口愈合，遷移，2D侵襲實驗，細胞共培養(yǎng)。
他們有預裝在μ35mm培養(yǎng)皿中的獨立插件，也有25個整體放在運輸培養(yǎng)皿中自己手動插入的。
它提供了一種快捷便利的實驗方法。
培養(yǎng)插件兩孔24是預裝在24孔板里面的，是非常劃算的，可以直接用于高通量實驗。
Ibidiμ兩孔載玻片的兩個孔的大小剛好可以插入培養(yǎng)插件。
2 活細胞成像
步驟：絕大多數情況下，傷口形成后立即使用相差顯微鏡監(jiān)測細胞的狀況。既可以在不同時間點（比如6和12小時后）拍攝傷口照片，也可以進行活細胞成像。通常監(jiān)測細胞24小時左右就足夠了。想要精確地分析，那么整個實驗過程中就需要觀察傷口的同一個位置。
Ibidi的解決方法：
Ibidi加熱和氣體孵育系統(tǒng)在顯微鏡下提供了一個生理環(huán)境。使得在傷口愈合和遷移實驗過程中可以進行活細胞成像。
3 數據分析
步驟：一個典型的傷口愈合或者遷移實驗生成GB數量的圖像數據，需要通過手動圖像分或者自動化軟件析進一步處理。眾多的實驗方法中，主要的結果就是傷口閉合的速度。其他結果可能包括無細胞區(qū)域和細胞覆蓋區(qū)域的測定。
Ibidi的解決方法：
使用傷口愈合ACAS圖像分析軟件，ibidi提供了一種省時全自動化定量分析傷口愈合和遷移實驗的方法。
它包括分析無細胞區(qū)域，細胞覆蓋區(qū)域以及傷口閉合速度。
4. 使用不同方法在細胞單層制造傷口：
1 插入：接種細胞前，在培養(yǎng)表面置入插件/模塊來物理性排除細胞。
2 劃痕：在表面劃痕（劃痕實驗）機械去除細胞。
3 阻抗：在特定區(qū)域內用電壓去除細胞。
Ibidi提供了三種不同的培養(yǎng)插件用于形成傷口：ibidi培養(yǎng)插件2孔，3孔以及4孔。
由于特殊設計的底部，培養(yǎng)插件黏附在表面，阻礙了壁下任何細胞的生長。移除培養(yǎng)插件后，新形成的無細胞傷口處沒有任何殘留。這種方法可以重復地形成高度一致的沒有任何細胞的傷口
當放置在平整，干凈的表面，培養(yǎng)插件2孔給培養(yǎng)的細胞提供了兩個儲液池，中間被500μm厚度的壁給分隔開。細胞接種在儲液池中培養(yǎng)，一直到他們貼壁，形成單細胞層。移除表面的硅膠插件后會形成兩個精確大小的細胞斑塊，由一個大小和分割壁一樣寬度的區(qū)域所分開。接著就可以通過活細胞成像或者在不同時間點拍照來監(jiān)測細胞遷移。
培養(yǎng)插件3孔提供了三個細胞儲液池。它可以形成兩個無細胞傷口，每個500μm. 因而適用于分析兩個技術重復樣本或者不同細胞類型的遷移。
培養(yǎng)插件4孔提供四個細胞培養(yǎng)儲液池。除了四個500μm的無細胞區(qū)域外，還包括一個1mm的中間傷口區(qū)域。培養(yǎng)插件4孔可以觀察四個技術重復樣本或者不同細胞類型的遷移。
培養(yǎng)插件3孔/4孔都可以在藥物處理或者基因沉默/過表達（比如通過CRISPR/Cas9, SiRNA, mRNA）
后進行細胞遷的分析。重要的是，未處理的對照組可以在同一個培養(yǎng)器皿里面接種，分析，共享同樣的培養(yǎng)液。
和其他傷口形成技術不同，ibidi的培養(yǎng)插件適合2D侵襲實驗和共培養(yǎng)實驗，同時可以實驗
兩種，三種甚至四種細胞類型或者處理方式。
5. ibidi培養(yǎng)插件部分客戶發(fā)表文章：
Inhibition of Tunneling Nanotube (TNT) Formation and Human T-cell Leukemia Virus Type 1 (HTLV-1) Transmission by Cytarabine.
Scientific Reports, 2018, 10.1038/s41598-018-29391-w
Stapled peptide inhibitors of RAB25 target context-specific phenotypes in cancer.
Nature Communications, 2017, 10.1038/s41467-017-00888-8
Endothelial Notch signalling limits angiogenesis via control of artery formation.
Nature Cell Biology, 2017, 10.1038/ncb3574
EphA2 Drives the Segregation of Ras-Transformed Epithelial Cells from Normal Neighbors.
Current Biology, 2016, http://dx.doi.org/10.1016/j.cub.2016.09.037
A molecular mechanotransduction pathway regulates collective migration of epithelial cells.
Nat Cell Biol, 2015, 10.1038/ncb3115
Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog
Nature, 2012, 10.1038/nature10807
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